Corona Virus Detection Kit Turkey

Açıklama

POLGEN-SENTEBIOLAB CORONAVIRUS DETECTION KIT

Coronaviruses are a group of viruses that cause diseases in mammals and birds. Although the pathologies they create in humans are usually in the form of mild respiratory infections, several coronavirus types cause severe pathologies such as SARS, MERS, and COVID-19.

Coronaviruses   belong   to   the   Orthocoronavirinae   subfamily   of   the Cornidoviridae family in Nidovirales subgroup and are single-stranded RNA viruses.  They  are  known  by  the  envelope  structure  around  them  and contain a positive sense RNA sequence. Their genome lengths range from about 25 to 35 kb and carry crown-like proteins of about 20 nm in size.

The  SARS-CoV-2 virus,  which  was  first  seen  in  Wuhan  in  2019,  is  the causative agent of COVID-19 which has spread all over the world. SARS-CoV-

2 is a coronavirus similar to SARS-CoV and COVID-19 manifests by high fever, shortness of breath and dry cough in infected patients. The mortality rate of this disease increases with age, and it is observed to be more severe in men and especially in smokers and those with chronic diseases. COVID-19 infection turns into pneumonia when it is severe.

How to take samples for this test?

The World Health Organization (WHO) recommends RT-PCR-based testing to establish a definitive diagnosis in cases where COVID-19 infection is suspected. It is recommended that the samples to be taken for this test are taken from the respiratory tract (mouth swab, nose swab, or mucus sample (if any), etc.).

How should the samples be transferred?

After taking the samples, it is very important to keep them in the cold chain. In the cases where the test laboratories can be reached immediately, the samples can be kept at +4 °C, in cases where it will take a long time to reach the test centers, the samples should be frozen at –20 °C or preferably at -70 °C and kept in dry ice.

What types of tests can be done for the diagnosis of coronavirus?

In  order  to  conduct  molecular  tests,  the  relevant  laboratories  must  meet  the  biosecurity requirements at least at the BSL-2 level. After the swabs arrive in the laboratory, RNA should be isolated from the samples. It is not recommended to use heat-treatment prior to RNA isolation. WHO has published qRT-PCR methods developed by China, Germany, Hong Kong, Japan, Thailand, USA, and France on its website and stated that one of them can be used for SARS-CoV-2 diagnosis. One of the most reliable of these methods is the method developed by the CDC agency of the USA; however, in the validation studies, this test method was observed to sometimes give false-positive results.

What is POLGEN-SENTEBIOLAB Coronavirus qRT-PCR kit?

Coronavirus qRT-PCR test kit, developed by the cooperation of POLGEN Biotechnology A.Ş. and Sentebiolab Biotechnology Ltd. Sti., has the ability to give results within 1 hour after RNA isolation. It is specially designed to diagnose SARS-CoV-2 virus, which causes COVID-19 disease. Our kit eliminates the problems (primary-dimer, probe-dimer formation) associated with the kit developed by CDC, and is currently the most accurate kit on the market. It contains primer-probe sets that recognize 3 different regions in the N gene of the SARS-CoV-2 virus in addition to the positive control primer-probe set and the positive control DNA sample.

ãAll rights are reserved to POLGEN Biotechnology A.Ş. and SENTEBIOLAB Biotechnology Ltd. Sti.

Kullanım Klavuzu

SARS-CoV-2 (COVID-19) qRT-PCR Tespit Kiti Kullanım Kılavuzu

  • Bu   kit   insan   numunelerinden   elde   edilen   cDNA örneklerinde   yeni   tip   koronavirüsün   (SARS-CoV-2) tespiti amacıyla geliştirilmiştir. Hasta numunelerinden elde edilen RNA örnekleri öncelikle standart yöntemler ile cDNA’ya çevrilmelidir.
  • Reaksiyon süresi 1 saattir, kullanılan qPCR cihazına göre ufak farklılıklar gösterebilir.
  • Kit içeriğindeki N1 ve N2 olarak adlandırılan primer ve problar   SARS-CoV-2  virüsüne  ait  nükleokapsid  (N) genini virüse spesifik olarak tanımaktadır. Bu primer ve problar genetik yapısı SARS-CoV-2 ile yüksek benzerlik taşıyan SARS-CoV virüsünü tanımamaktadır ve SARS- CoV-2   virüsünün   spesifik   olarak   teşhisi   amacıyla geliştirilmiştir.
  • Kit  içeriğinde  bulunan  RNAseP  primer  ve  probları numunelerden hazırlanan cDNA örneklerinin kalitesini kontrol amaçlıdır ve insan RNAseP genini tanımaktadır.
  • Kit içeriğinde bulunan kalıp DNA pozitif kontrol amaçlı kullanılmak üzere hazırlanmış bir sentetik DNA’dır. N1, N2  ve  RNAseP  genlerinin  sadece  bu  kitte  yer  alan primer-prob  setleri  ile  çoğaltılan  hedef  bölgelerini içermektedir.  Virüsten  izole  edilmemiştir,  tüm  virüs genomuna sahip değildir ve herhangi bir enfekte edici özelliği yoktur.

SAKLAMA KOŞULLARI

  • Sulandırılmamış ürünler -20 °C / +4 °C’de saklanmalıdır.
  • Sulandırılan primerler (10 µM), problar (5 µM) ve kalıp DNA +4 °C’de bir ay saklanabilir.
  • Problar   ışığa    duyarlıdır   ve   kahverengi   viallerde gönderilmiştir.    Aliquotlanan    probların   da   ışıktan korunması gerekmektedir.

PREPARATION PRIMER AND PROBE SOLUTIONS

Primer ve probları 200 µL nükleaz içermeyen su/TE (Tris- EDTA) tampon çözeltisi ile sulandırın.

DISSOLVING THE POSITIVE CONTROL DNA

  1. Kitte yer alan Kalıp DNA’yı 100 µL nükleaz içermeyen su ile   sulandırın.   Vorteks   kullanmadan,   pipetleyerek karıştırın. Elde edilen Kalıp DNA çözeltisi stok çözeltidir, aliquotlanarak -20 °C’de saklanmalıdır.
  1. Çalışılacak konsantrasyondaki  Kalıp  DNA  çözeltisini hazırlamak için stok kalıp DNA çözeltinizi 1:10 oranında seyreltin. Örneğin 100 µL Kalıp DNA çözeltisi için 10 µL stok   kalıp   DNA   +   90   µL   nükleaz   içermeyen   su kullanılmalıdır. Seyreltilmiş Kalıp DNA çözeltisi +4 °C’de bir ay saklanabilir.

qPCR PROTOKOLÜ

NOT:     Tüm     çalışma     buz/soğuk     plaka     üzerinde yürütülmelidir.

NOT:   Hasta   numuneleri   ile   çalışılırken   gerekli   tüm biyogüvenlik önlemleri alınmalıdır.

1.Bu kit bir multipleks PCR kiti değildir, her hasta örneği için eş zamanlı olarak farklı tüplerde yapılacak 3 farklı qPCR reaksiyonu ile çalışılmak üzere tasarlanmıştır. Her numune için çalışılacak olan reaksiyonlar (rxn) Tablo 2’de verilmiştir.

Tablo 2. Her numune ile ayrı tüp/kuyucuklarda çalışılacak olan qPCR reaksiyonları.

Primer/Prob Seti Hedef Bölge
Rxn 1 N1 SARS-CoV-2 spesifik

nükleokapsid geni

Rxn 2 N2 SARS-CoV-2 spesifik

nükleokapsid geni

Rxn 3 RNAse P İnsan RNAse P geni

2.Her çalışmada mutlaka negatif kontrol (NK) ve pozitif kontrol (PK) kullanılmalıdır:

a.Negatif kontrol olarak kullanılacak olan kuyucuk/tüplere DNA yerine nükleaz içermeyen su eklenmelidir.  Negatif  kontrolün  amacı  kullanılan malzemelerde  herhangi  bir DNA kontaminasyonu olmadığının  tespitidir.  Hasta  örneklerinde  yanlış pozitif   değerlendirme   yapılmaması   için   negatif kontrol  çalışılması  zorunludur.  DNA  eklenmeyen negatif kontrol örneklerinde amplifikasyon olmamalıdır.kuyucuk/tüplere  kalıp  DNA  eklenmelidir.

b.Pozitif kontrolün amacı    çalışma  kaynaklı hatalardan oluşabilecek  yanlış  negatif  vakaların    önüne geçmektir. Hasta -örneklerinde   yanlış    negatif değerlendirme   yapılmaması   için   pozitif   kontrol çalışılması  zorunludur.  Pozitif  kontrol  örneklerde mutlaka amplifikasyon görülmelidir.

NOT:  Aşağıda  verilen  protokol  iTaq  Universal  Probes Supermix (BioRad, 1725130) ürünü  kullanılarak BioRad CFX Connect (1855201) qPCR cihazında optimize edilmiş protokoldür.  Farklı  bir  kit/cihaz  kullanımında  sadece negatif  kontrol  ve  pozitif  kontrol  kullanarak  bir  ön deneme yapılmalı ve gerekli durumda kullanılan kit ve cihazın tavsiyeleri doğrultusunda reaksiyon şartları optimize edilmelidir.

3.Kullanılacak olan plate/strip tüplerin kuyucuklarını her numune 3 set ile çalışılacak şekilde tasarlayın ve qPCR cihazının software’ine bu şekilde giriş yapın. Örnek bir plate tasarımı aşağıda verilmiştir (S1: numune 1, S2: numune 2…, NK: negatif kontrol, PK: pozitif kontrol)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A S1-

N1

S2-

N1

S3-

N1

S4-

N1

S5-

N1

S6-

N1

S7-

N1

S8-

N1

S9-

N1

S10-

N1

NC-

N1

PC-

N1

B S1-

N2

S2-

N2

S3-

N2

S4-

N2

S5-

N2

S6-

N2

S7-

N2

S8-

N2

S9-

N2

S10-

N2

NC-

N2

PC-

N2

C S1-

RP

S2-

RP

S3-

RP

S4-

RP

S5-

RP

S6-

RP

S7-

RP

S8-

RP

S9-

RP

S10-

RP

NC-

RP

PC-

RP

D
E
F
G
H
  1. Her bir  primer-prob  seti  için  (N1,  N2,  RNAseP)  için reaksiyon karışımına eklenecek olan ürün miktarlarını Tablo 3’e göre hesaplayın.

 

Tablo 3. Her primer-probe seti için (N1, N2, RNAseP) ayrı ayrı hazırlanacak olan reaksiyon karışımları. Tek seferde çalışılacak olan numune sayısı (n) kontroller dahil 14 veya daha az ise N=n+1, 15 veya daha fazla ise N=n+2 olmalıdır.

 

20 µL reaksiyon için

eklenecek hacim

iTaq Universal Probes

Supermix (2x)

N x 10 µL
10 µM F primer N x  1 µL
10 µM R primer N x  1 µL
5 µM probe N x  1 µL
Nükleaz içermeyen su N x  2 µL
  1. Tablo  3’e  göre her set için karışımları hazırlayın ve hazırladığınız karışımları pipetleyerek karıştırın ve spin down yapın.
  2. Her sete ait kuyucuklara o sete ait karışımdan 15 µL ekleyin.
  3. Tüm  karışımların  kuyucuklara  dağıtılmasından  sonra numunelere  ait  cDNA’lardan  ilgili  kuyucuklara  5  µL ekleyin.
  4. NK kuyucuklarına cDNA yerine 5 µL nükleaz içermeyen su ekleyin.
  5. PK kuyucuklarına 5 µL (seyreltilmiş) kalıp DNA ekleyin.
  6. Tüp/plate’inizi optik geçirgen malzeme (kapak/seal) ile kapatın.
  7. Strip tüp kullanılmışsa spin down yapın, 96 well plate kullanılmışsa kısa bir santrifüj (plate rotor kullanarak -30 sn, 500 g) yapın.
  8. qPCR  cihazının  software’inde  reaksiyon  protokolünü aşağıdaki basamaklara göre oluşturun:

    95 °C-5 dk
    95 °C-5 sn
    40 Döngü
    60 °C-30 sn

  9. Hazırladığınız strip tüp/plate’i qPCR cihazına yerleştirin ve reaksiyonu başlatın.

SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ

  • Her  çalışmada  NK’lerden negatif,  PK’lerden pozitif sonuç alınmalıdır. Bu şekilde sonuç alınmayan çalışmalar mutlaka tekrarlanmalıdır.
  • Her numunede RNAseP’den pozitif sonuç alınmalıdır. Bu   şekilde   sonuç   alınmayan   numunelerin   RNA izolasyon/cDNA eldesi aşamalarında problem vardır, numuneden tekrar RNA izolasyonuna gidilmelidir.
  • Tablo  4’de  belirtildiği  üzere  N1,  N2  ve  RNAseP setlerinin    tamamından     pozitif     sonuç    alınan numuneler  SARS-CoV-2  pozitif;  N1  ve  N2  negatif, RNAseP pozitif sonuç alınan numuneler SARS-CoV-2 negatif  olarak değerlendirilmelidir. N1 veya N2’den sadece birinden pozitif sonuç alınan numuneler tekrar test edilmelidir.

Tablo 4. qPCR sonuçlarının değerlendirilmesi.

N1 N2 RNAseP Assessment
+ + + Hasta SARS-CoV-2 pozitiftir.
+
Hasta SARS-CoV-2 negatiftir.
+ + Kesin olmayan sonuç, test

tekrarlanmalıdır.

+ +
Detection Process
covid 19 corona virus detection kit

Corona Virus Detection Kit Stages

This post is also available in: İngilizce